Mecanismos de reducción del sulfuroso combinado durante FA: gestión del metabolismo del acetaldehído

V. Puente^1*, R. García¹, A. Vazquez¹, L. Cancho¹, S. Paniagua^2
1LAFFORT® España S.A.
²Gordonzello S.A.
*vi***********@*****rt.com

Bien es conocido que el dióxido de azufre (SO₂) es un importante aditivo alimentario utilizado en vinos por sus propiedades antioxidantes, antimicrobianas y antioxidásicas. Siendo un gas a temperatura ambiente, una vez disuelto en agua, se disocia en tres fracciones: SO₂ molecular (SO₂, H₂O), bisulfito (HSO₃-) y sulfito (SO₃-), donde el pH y las constantes termodinámicas modulan las proporciones de las diferentes formas, siendo la fracción de SO₂ molecular la parte fundamental en el control microbiológico dependiente totalmente de la fracción libre (antioxidante) del SO₂ (Fig. 1).

Fig. 1. Equilibrio químico del sulfuroso total en vinos.

El continuo incremento del pH observado en estos últimos años provoca que ambas fracciones, microbiocida y antioxidante, el SO₂ molecular y el SO₂ libre, sean cada vez más bajos para una misma concentración de sulfuroso total.  La pérdida del control microbiológico debido a la subida del pH para un mismo SO₂ libre, está asociado al incremento de SO₂, dado que el ion bisulfito que forma parte de esa fracción libre, es muy susceptible de unirse a metabolitos como el acetaldehído, el ácido succínico o el ácido α-cetoglutárico, compuestos principalmente fermentativos que incrementan su presencia en cuanto la microbiología se ve en esta situación de permisividad microbiana.

Este aumento supone un riesgo dado que la cantidad máxima total de sulfuroso que puede tener un vino está totalmente regulada (R (UE) 2019/934), por lo que un vino se puede ver en una situación extrema donde para un pH elevado, el SO₂ total máximo sea totalmente inocuo por presentar un elevado % de SO₂ combinado y un bajo % de SO₂ molecular.

Cuantitativamente, el acetaldehído es el principal compuesto carbonílico formado durante la fermentación alcohólica y el que se une fuertemente al SO₂, reduciendo su eficiencia antimicrobiana (1) y pudiendo ser el responsable de entre el 50% y el 70% del SO₂ combinado de los vinos (2). Su control y reducción durante los procesos fermentativos se presentan fundamentales y son la base de los trabajos que presentamos a continuación, mostrando diferentes vías en la disminución de la producción del acetaldehído durante la fermentación alcohólica y conservación de vinos y, por tanto, la reducción del SO₂ combinado.

Materiales y métodos

Los ensayos de aplicación de BIOProtección se realizaron 2024 en Bodegas Gordonzello sobre uva Prieto Picudo en aplicación sobre remolque de 5,500 kg en 2 aplicaciones de SUPRAROM® o ZYMAFLORE® ÉGIDE^TDMP, la primera a mitad de llenado y la otra mitad al final de llenado, espolvoreando los productos para asegurar la estratificación de ambos. El tiempo de transporte entre la aplicación y la recogida de muestras en entrada de bodega fue de 1 hora. Para el análisis de los mostos resultantes se recogió las muestras del doble fondo en el momento de la descarga. Los análisis microbiológicos fueron cuantificados a través de Laboratorios Excell Ibérica por medio de PCR en tiempo real (Scorpion) con bloqueante de células de pared celular comprometida con monoazida de propidio (PMAX).

Los análisis de sulfuroso libre y total se realizaron por titrimetría y flujo contino en Laboratorios Excell Ibérica (Logroño-Rioja).

Los análisis de aminoácidos de los nutrientes empleados fueron desarrollados por Laboratorios Excell Ibérica a través de Cromatografía líquida / fluorescencia – OPA (HPLC).

El ensayo de la producción de acetaldehído en fermentación alcohólica fue realizado en laboratorio LAFFORT® por duplicado, sobre matraces de 500 mL sobre mosto moscatel 2024 sembrado con 20 g/hL de ZYMAFLORE® X5, dejando un testigo como control, y el resto aplicando SUPERSTART® a 20 g/hL en el agua de rehidratación, THIAZOTE® ph 20 g/hL (nutrición inorgánica, aporte NFA 42 mg/L), NUTRISTART® ORG 40 g/hL (nutrición orgánica, aporte NFA 40 mg/L) o metabisulfito potásico 90 mg/L (50 mg/L de SO₂). El análisis de acetaldehído se realizó en Laboratorios Excell ibérica por medio enzimático.

El ensayo del seguimiento de aldehídos de Strecker, el fenilacetaldehído, se realizó sobre mosto airén 2024 por duplicado en matraces de 500 mL, utilizando un mosto sin aplicación como testigo, otro con un tratamiento con 40 g/hL de NUTRISTART® ORG. Los reactivos L-Fenilalanina >= 99.0% y Fenilacetaldehído fueron obtenidos a través de Merck Life Science. El análisis de fenilacetaldehído se realizó a través de Laboratorios Excell Ibérica.

Resultados

Gestión de sulfuroso antes de fermentación.
Todo comienza con una reflexión a través de los resultados de varios ensayos realizados en laboratorio sobre mosto Airén en 2023. Aplicando en entrada del mosto una dosis de 80 mg/L de SO₂ frente al mismo mosto con 40 mg/L, se llevó a cabo un seguimiento de la fermentación alcohólica y tras su finalización (<4 g/L azúcares residuales), se analizó el SO₂ presente sobre el vino final. Como era de esperar, el vino con 80 mg/L presentó 18 mg/L más de SO₂ combinado que el vino con 40 mg/L para exactamente la misma concentración de SO₂ libre, 7 mg/L, demostrando que la aplicación excesiva de sulfuroso en entrada de mosto está directamente relacionada con un aumento del sulfuroso combinado y, por tanto, más alto SO₂ total para un mismo SO₂ libre (Tabla 1.).

Tabla 1. Influencia del aporte en mosto de SO₂ sobre el SO₂ combinado.

Alternativas del SO₂ antes de fermentación.
Dado que el aumento de SO₂ en entrada de uva es la principal vía de subida del sulfuroso combinado, se realizaron ensayos de BIOProtección. Bajo este concepto se engloba el empleo de microorganismos seleccionados propios de la microflora de uvas o mosto, cepas cualitativas y de fermentación débil, y que sean capaces de colonizar el mosto reduciendo las poblaciones de microrganismos indeseables que puedan depreciar la calidad de los vinos. En el ensayo, fue testada la efectividad de ZYMAFLORE® ÉGIDE^TDMP (mezcla 50 / 50% Torulaspora delbrueckii y Metschnikowia pulcherrima) frente al SUPRAROM® (producto con 25% de SO₂). Los resultados mostraron como la BIOProtección a la dosis empleada de
3 g/100 kg fue microbiológicamente hablando mucho más eficaz que el empleo de 25 mg/L de sulfuroso total (10 g/hL SUPRAROM®), mostrándose como una herramienta eficaz en control microbiológico y por tanto alternativa al sulfuroso en esta vía de trabajo.

Fig. 2. Influencia de la BIOProtección con 3 g/hL de ZYMAFLORE® ÉGIDE o 10 g/hL de SUPRAROM® (25 mg/L SO₂) aplicado en uva sobre la población microbiológica.

Gestión del acetaldehído durante la FA:
Diversos autores (3) han puesto de manifiesto como la producción de acetaldehído comienza con una producción temprana probablemente vinculada a la desintoxicación del medio de SO₂ por parte de Saccharomyces cerevisae, incluso antes de cualquier producción detectable de CO₂, pudiendo ser este compuesto, el acetaldehído, un marcador temprano de la actividad fermentativa general de la presencia de levaduras.

Además (4) el seguimiento del metabolismo del acetaldehído muestra una acumulación durante la fase de crecimiento de la levadura hasta un pico máximo que tiende a coincidir con el final de la fase exponencial para posteriormente ser parcialmente reutilizable por la levadura. En nuestro ensayo, empleando diferentes criterios a nivel nutricional (nutrición orgánica, inorgánica o rehidratación en base a un compuesto que aporte ácidos grasos insaturados y esteroles), los niveles más bajos de acetaldehído fueron observados con el empleo del rehidratador en el agua de rehidratación, mostrando así mismo un buen comportamiento en su reducción la elaboración realizada con la nutrición orgánica. Se puede observar cómo estos niveles más bajos de acetaldehído al final de FA se debieron principalmente a una menor producción durante la primera fase de la FA, es decir hasta el final de la fase exponencial, lo cual derivaría a que en ambos casos Saccharomyces cerevisae pudo estar mejor adaptada al estrés generado en esas primeras fases de la fermentación. El empleo de nutrición inorgánica no pareció ejercer ningún efecto diferenciador frente a los depósitos control.

Fig. 3. Influencia de diferentes tratamientos empleados al inicio de FA sobre la producción de acetaldehído por Saccharomyces cerevisae.

Gestión de los aldehídos de Strecker:
Aunque el principal aldehído relacionado con la oxidación y con el sulfuroso combinado es el acetaldehído (descriptor manzana oxidada), existen otra familia de aldehídos (isobutiraldehído, 2-metilbutanal, isovaleraldehído, metional, fenilacetaldehído) pertenecientes al grupo de los aldehídos de Strecker, que bien se pueden originar a partir de sus propios alcoholes por peroxidación o bien a través de la degradación del aminoácido precursor correspondiente. Organolépticamente, junto al acetaldehído son los principales compuestos responsables de los aromas de oxidación prematuros (5) que se encuentran en muchos vinos (el metional descriptor de col cocida y el fenilacetaldehído descriptor a miel o rosa marchita).

Sin embargo, a diferencia del acetaldehído que presenta una unión estable e irreversible con el SO₂, los aldehídos de Strecker tienen la capacidad de unirse reversiblemente al SO₂ y formar α-hidroxialquilsulfonatos, y por tanto actuar como un reservorio inodoro de aldehídos olorosos que se liberarán a medida que el SO₂ se va agotando durante la oxidación del vino.

En un experimento llevado en 2024, aplicamos al inicio de la fermentación un aminoácido puro,
L-fenilalanina frente a un nutriente 100% orgánico, NUTRISTART® ORG con un tercer ensayo como control sin aporte nutritivo. La concentración de L-fenilalanina del NUTRISTART® ORG analizado fue de 38.0 ± 1.0 mg/g (media 2 resultados). A la dosis empleada de 40 g/hL significa un aporte de este aminoácido de 1.52 g/hL, 3.3 veces menos que el aporte del aminoácido puro de este ensayo. Habiendo partido en el mosto original con unos niveles de fenilalanina bajos (fenilalanina en mosto original = LC < 5 mg/L), todos los vinos terminaron la fermentación con una concentración ligeramente más elevada que el mosto de partida, indicando una probable liberación natural durante el final de FA por las células en lisis, pero prácticamente sin diferencia en las modalidades de aporte nutritivo, mostrando la capacidad metabólica de la levadura hacia ese aminoácido.

Sin embargo, si se encontraron diferencias importantes en cuanto al fenilacetaldehído producido en la muestra dosificada con L-fenilalanina, finalizando con el mismo factor de incremento, 3.3 veces superior la concentración de fenilacetaldehído que con la nutrición orgánica.  Este último mostró un ligero descenso en la producción de este compuesto frente a los depósitos control (26% menos). Para explicar la eficiencia metabólica nitrogenada observada con el nutriente 100% orgánico frente a la no nutrición, tan solo podemos teorizar sobre una posible optimización del metabolismo aminoacídico a nivel bioquímico de manera directa hacia el consumo necesario de este aminoácido, fenilalanina, en vías metabólicas diferentes alternativas a la formación de aldehídos o bien de manera indirecta a través de una menor producción de acetaldehído durante el proceso (datos observados en la experiencia anterior) que generaron una  reducción del fenilacetaldehído producido por vía oxidativa.

Fig. 4. Producción de fenilacetaldehído según la nutrición empleada en FA.

Tras la finalización de FA, en otro ensayo, se añadió 50 mg/L de SO₂ a dos vinos, uno se tomó como control, mientras que el otro fue conservado de igual manera, pero con 50 mg/L de fenilacetaldehído aportado directamente. Tras 3 meses de conservación, el vino con fenilacetaldehído añadido presentó niveles más elevados de acetaldehído (+33%) y de sulfuroso combinado (+29%). La presencia de fenilacetaldehído dentro de un vino actuó él mismo como un catalizador de oxidación, bien de manera directa promoviendo la producción de acetaldehído, bien de manera indirecta reduciendo los niveles de SO₂ libre y por tanto favoreciendo fenómenos oxidativos y el aumento de acetaldehído derivado.

Fig. 5. Influencia del fenilacetaldehído sobre el SO₂ combinado.

Conclusiones

La situación que vive hoy en día los viñedos, con el cada vez más recurrente estrés térmico, caídas de acidez y subidas de pH en las uvas, nos empuja a buscar alternativas que posibiliten mantener el sulfuroso combinado en niveles bajos con el fin de mantener elevada la concentración del sulfuroso libre.

A través de los trabajos aquí presentados, observamos como varios factores han afectado a la disminución de la producción de acetaldehído, principal molécula implicada en la combinación con el SO₂. Disminuir la aplicación de sulfuroso en la entrada de mosto/uva fue fundamental para reducir la formación de acetaldehído durante la fermentación alcohólica. Como vía alternativa a esta reducción sin alterar el control microbiológico, la bioprotección se postuló como el eje esencial para poder bajar las dosis iniciales de SO₂. Estrategias como la correcta rehidratación de la levadura, o una nutrición orgánica equilibrada de la levadura, posibilitaron en nuestros ensayos el control y reducción de los niveles de acetaldehído durante la elaboración de los vinos.

De igual manera, hemos observado como una nutrición equilibrada consiguió disminuir la producción de fenilacetaldehído y como el incremento desmesurado en la concentración de este aminoácido en un mosto, L-fenilalanina, incrementó proporcionalmente la presencia de este aldehído de Strecker altamente referenciado en la bibliografía como marcador de oxidación. El control de este aldehído de Strecker, posibilitó una reducción del sulfuroso combinado y del acetaldehído, acción fundamental para mantener los niveles de sulfuroso libre altos durante la conservación de los vinos.

Bibliografía

(1) Jackowetz JN, Dierschke SE, Mira de Orduña R (2011) Multifactorial analysis of acetaldehyde kinetics during alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Food Res Int 44:310–316.
(2) Jackowetz JN, Mira de Orduña R (2013) Survey of SO2 binding carbonyls in 237 red and white table wines. Food Control 32:687–692.
(3) Cheraiti, N., Guezenec, S., & Salmon, J.-M. (2010). Very early acetaldehyde production by industrial Saccharomyces cerevisiae strains: A new intrinsic character. Applied Microbiology and Biotechnology, 86(2), 693‑700.
(4) Acetaldehyde kinetics of enological yeast during alcoholic fermentation in grape must. Erhu Li1 · Ramón Mira de Orduña. J Ind Microbiol Biotechnol (2017) 44:229–236.
(5) Cullere, L.; Cacho, J.; Ferreira, V. An assessment of the role played by some oxidation-related aldehydes in wine aroma. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 876–881.